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RNA 5mC重亚硫酸盐测序的文库构建方法及其应用

本发明涉及对 RNA 分子上的 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC) 修饰重亚硫酸盐测序的文库构建方法、测序方法和甲基化检测方法。通过设 计和使用只含有 ACT 的三碱基随机六聚引物,显著提高经过重亚硫酸盐处 理后的 RNA 片段的逆转录和 PCR 扩增效率和 5mC 位点的检测效率,有利 于对 5mC 位点的高通量测序。 该技术从2015年开始研发至2020年成功申请专利,可以配套进行试剂盒的研发。

#生物医药
中试

技术详情

1. 提高重亚硫酸盐处理后的 RNA 样品的逆转录效率的方法,其特征在于:

利用 ACT 三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的 RNA 样品进行逆转录,合成 cDNA。

2.RNA 5mC 重亚硫酸盐测序文库构建方法,其特征在于包括以下步骤:

(1)将 RNA 样品片段化;

(2)对片段化的 RNA 样品进行重亚硫酸盐处理;

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进行逆转录,合成 cDNA;

(4)用逆转录合成的 cDNA 构建测序文库。

3. 根据权利要求 1 的测序文库构建方法,其中所述测序文库适合于在Illunima Hiseq 测序平台上进行测序。

4.一种 5mC 甲基化 RNA 的测序方法,其特征在于包括以下步骤:

(1)将 RNA 样品片段化;

(2)对片段化的 RNA 样品进行重亚硫酸盐处理;

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进

行逆转录,合成 cDNA;

(4)用逆转录获得的 cDNA 构建测序文库;

(5)进行高通量测序。

5.一种 RNA 5mC 甲基化检测方法,其特征在于包括以下步骤:

(1)将 RNA 样品片段化;

(2)对片段化的 RNA 样品进行重亚硫酸盐处理;

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进

行逆转录,合成 cDNA;

(4)用逆转录合成的 cDNA 构建测序文库;

(5)进行高通量测序;

(6)对测序结果进行数据分析,获得 RNA 的 5mC 甲基化信息。

6.根据权利要求1-5任一项的方法,其中所述RNA是mRNA、tRNA、rRNA、总 RNA 或其它包含或可能包含 5mC 甲基化位点的 RNA。

7. 根据权利要求 8 的方法,其中所述非甲基化 RNA 标准品是小鼠 DHFR基因的 RNA 序列。

8. 根据权利要求 1-6 任一项的方法,其中所述重亚硫酸盐处理基本上完全将 RNA 样品中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

9.根据权利要求 2、3、6-8 任一项的测序文库构建方法构建的测序文库,10.权利要求 9的测序文库在 RNA 甲基化检测中的应用。11 .ACT 三碱基的随机六聚引物在 RNA 5mC 甲基化检测中的应用,所述RNA 5mC 甲基化检测包括将 RNA 样品片段化、重亚硫酸盐处理、逆转录合成 cDNA、高通量测序和数据分析的步骤,其特征在于:在对重亚硫酸盐处理后的 RNA 进行逆转录时,使用 ACT 三碱基的随机六聚体作为引物。

13. 根据权利要求 11的应用,其中 RNA 样品是非甲基化 RNA 标准品与分离纯化的待测 RNA 以 1:100(重量比)的比例混合的混合物。

14. 根据权利要求 13 的方法,其中所述非甲基化 RNA 标准品是小鼠 DHFR基因的 RNA 序列。

15. 其中所述重亚硫酸盐处理基本上完全将 RNA样品中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

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