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PCV2 LAMP现场可视化定性和荧光定量PCR快速检测试剂盒

该项目针对断奶猪仔多系统衰竭综合征为此建立的PCV2 LAMP现场可视化定性和荧光定量PCR快速检测支撑技术并成功开发出试剂盒。将两种试剂盒组合起来防控PMWS,最大限度减少养殖户经济损失。可适用在畜牧兽医、生物制品等行业。

#生物医药
中试

技术详情

断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的一种重要疾病,严重发病地区死淘率达40%以上。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统,使各种疫苗免疫失败。因此,PCV2感染的早期诊断和病猪的淘汰成为PMWS防治的重点。有鉴于此,申请人提出了PMWS防控新策略:

(1)首先养殖户用PCV2 LAMP试剂盒定性检测猪群,将被PCV2感染的猪与健康猪隔离开来,防止交叉感染。

(2)用定量PCR试剂盒对被PCV2感染的猪进行定量检测,文献报道猪体内PCV2病毒超过4 000拷贝/mL血液就会患病,而患病猪很难康复,因此,建议将PCV2病毒超过4 000拷贝/mL血液的猪直接淘汰。

(3)母猪会将PCV2传播给仔猪,公猪会将PCV2传播给母猪,因此养殖户用PCV2 LAMP试剂盒定性检测种猪,将被PCV2感染的种猪直接淘汰。因此,通过以上两种方法组合起来进行检测、隔离和对病猪的适当淘汰可以防控PMWS,最大限度减少养殖户经济损失。

为此该团队建立了PCV2 LAMP现场可视化定性和荧光定量PCR快速检测支撑技术并成功开发出试剂盒。将两种试剂盒组合起来防控PMWS,最大限度减少养殖户经济损失。

目前PCV2检测方法的局限性

目前, PCV2 的诊断主要依靠免疫学检测技术和分子生物学检测技术。由于免疫学技术自身敏感性和特异性较差, 因此分子生物学检测技术得到了迅速的发展。

(1) PCR技术:易导致假阳性或假阴性结果出现;

(2) ELISA检测:每种基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法,要建立所有基因产品的蛋白质检测法工作量很大;

(3)基因芯片:不仅需要昂贵的芯片制作系统,操作复杂、费时,对操作人员的专业素质要求比较高,容易造成样品污染。

技术介绍

针对上述问题, 该研究建立猪圆环病毒Ⅱ型的环介导等温扩增(LAMP)现场可视化快速检测方法以及TaqMan荧光定量PCR检测方法,将这两种检测技术组合起来防控PMWS

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).

LAMP技术在核酸特异性扩增和检测领域已经显示出强大的威力,具有取代PCR扩增和检测的趋势,但该技术在畜牧兽医领域的应用研究较少。LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、速度快、产物检测便捷、成本低等五个方面的优点。

实时荧光定量PCR技术

到目前为止是敏感性最高的核酸检测和定量技术。

技术路线

该团队的PCV2 LAMP 定性检测方法和PCV2荧光定量PCR定量检测方法与前人有许多不同:

(1)PCV2 LAMP现场可视化快速定性检测试剂盒:

a.设计的PCV2 LAMP引物序列未见报道;

b.增加了一对环引物,可使LAMP反应时间减少一半,这是前人工作所没有的;

c.在LAMP反应体系中添加了甜菜碱,加速了解链速度,这是前人工作所没有的;

d.减少了PCV2病毒核酸的提取步骤,首创了不提取PCV2病毒核酸,直接以猪血清样品为模板,直接加入反应体系进行LAMP反应,减少了操作的时间和步骤,降低了成本。

(2) PCV2荧光定量PCR定量检测试剂盒:

a.设计的荧光定量PCR引物和探针序列未见报道;

b.创造和优化了PCV2荧光定量PCR反应体系和参数,有效提高了PCV2荧光定量PCR反应效率,结果大大优于前人的报道;

(3)在世界上首次提出了将基于LAMP现场可视化快速定性检测方法和荧光定量PCR定量检测方法组合起来进行猪PCV2定性、定量现场快速可视化检测以防控PMWS的检测理论和技术。

检测灵敏度达到进出口农产品检测国际标准。无论在技术水平、还是试剂盒的灵敏度上均高于与国内外同类研究。

数据结果

(1)开发PCV2 LAMP现场可视化快速定性诊断试剂盒:

a.灵敏度:PCV2检测限:10拷贝/25ul反应液;b.特异性:与其它病毒DNA或cDNA无交叉反应;c.重复性:批内变异系数小于10%;批间变异系数小于20%;d.检测时间少于1小时;e.临床样品PCV2检出率70%;f.可进行可视化检测。

(2) 开发PCV2荧光定量PCR定量诊断试剂盒:

a.灵敏度:PCV2检测限:10拷贝/25ul反应液;PCV2定量限:100拷贝/25ul反应液;b.特异性:与其它病毒DNA或cDNA无交叉反应;c.重复性:批内变异系数小于10%;批间变异系数小于20%;d.临床样品PCV2检出率72%。

这两个试剂盒国内没有上市,属填补国内空白,成本每头份几元钱,售价几十元钱。全国每年存栏、出栏猪约10亿头。若有10%猪使用,将产生几十亿的销售额。

合作方式

两个试剂盒打包转让1500万元。本实验室配合受让方申报药证。

应用行业

畜牧兽医行业;生物制药厂、兽药厂、生物制品厂。

获奖认证

上海市科学技术奖证书

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