技术成果列表 技术成果详情

α-L-鼠李糖苷酶的高效发酵工艺产业化

该项目构建了一株鼠李糖苷酶高效生产菌种:细丽毛壳菌重组菌;优化了发酵工艺路线,建立了发酵过程控制策略,喷粉后酶活高达3500 U/ml,生产成本约为750元/Kg(市场鼠李糖苷酶价格1100元/Kg),产品指标达到国内先进水平。

#生物医药
中试

技术详情

技术背景

α-L-鼠李糖苷酶的真菌来源丰富,包括曲霉、孢霉、青霉、根霉和木霉等。α-L-鼠李糖苷酶(RhaB)由1个α结构域和5个β结构域组成。结构域A为桶状结构,结构域N、F、D、E共同形成β-卷心折叠。结构域A和结构域D中结合有L-鼠李糖,是该酶的活性中心,决定了酶的活力大小。α-L-鼠李糖苷酶主要通过微生物发酵法获得,但该方法存在发酵活力低、产量低、生产成本高等限制性因素,限制了它的广泛应用。  

目前,α-L-鼠李糖苷酶的发酵技术不成熟、制剂工艺缺乏,导致成品酶价格高昂,严重限制了酶的应用。国内外关于α-L-鼠李糖苷酶的液态发酵的研究主要为实验室规模,工业级规模缺乏报道。开发难点主要是:缺乏高产酶菌株;工业化生产技术还存在很多缺陷,成本偏高、效率低下。

技术原理

该项目构建了一株鼠李糖苷酶高效生产菌种:细丽毛壳菌重组菌;优化了发酵工艺路线,建立了发酵过程控制策略,喷粉后酶活高达3500 U/ml,生产成本约为750元/Kg(市场鼠李糖苷酶价格1100元/Kg),产品指标达到国内先进水平。

(1)酵母菌表达系统方面,主要分为固态发酵和液态发酵。固态发酵最高酶活为4 U/mg,液态发酵最高酶活为691 U/mL。

(2)真菌表达系统方面,利用霉菌进行固态发酵产α-L-鼠李糖苷酶,最高酶活为794 U/mL。 关键技术的研发:

1.重组菌构建

利用根癌农杆菌转化系统,构建含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒;将质粒导入到农杆菌感受态细胞中,并将宿主菌细丽毛壳菌悬液与根瘤农杆菌菌液混匀共培养,获得含有α-L-鼠李糖苷酶的重组细丽毛壳菌。这个方法在α-L-鼠李糖苷酶的菌种构建领域国内外还没有类似报道。

2.独特的高效发酵工艺

特别添加α-L-鼠李糖苷酶底物柚皮苷,不但起到丰富碳源的作用,还是有效的α-L-鼠李糖苷酶诱导剂;采用半连续流加发酵策略,在保持最佳碳氮源比例的同时,持续诱导重组菌产生α-L-鼠李糖苷酶。该发酵工艺已经申报专利,具有创新性。

3.全水化提取工艺

首先采用板框去除菌体,然后用超滤膜过滤浓缩,最后用喷粉塔造粉成品。整个过程全部采用水化处理,避免了乙醇等有机溶剂的污染,提取工艺环保、友好。

应用影响

鼠李糖苷酶用于去除柑橘汁中柚皮苷的苦味;还可以作用于葡萄酒增香;还可以用于在沙棘黄酮的生物转化,提高黄酮类物质的活性;还可以用于水解皂苷,合成类固醇药物。

1.柑橘汁脱苦:柑橘类果实经压榨制得的果汁会出现苦味,柚皮苷是引起苦味的关键物质,α-L-鼠李糖苷酶能够把柚皮苷水解为普鲁宁和α-L-鼠李糖,减少苦味口感。

2.葡萄酒增香:葡萄酒的香气来源于香茅醇和β-萜烯醇等挥发性物质。在α-L-鼠李糖苷酶和其他酶的联合作用下,可以水解葡萄皮中二糖苷并释放挥发性萜烯醇,实现葡萄酒增香。

3.药物和药物前体的制备:鼠李糖是重要的手性中间体,而α-L-鼠李糖苷酶可以从含有末端L-鼠李糖的糖苷中切割L-鼠李糖。如水解皂苷,产生α-L-鼠李糖和薯蓣皂苷元,可用于合成临床上的类固醇药物,例如孕酮等。

技术优势

1.重组菌的构建:细丽毛壳菌重组菌;

2.优化了发酵工艺路线,建立了发酵过程控制策略;

3.喷粉后酶活高达3500 U/ml,生产成本约为750元/Kg(市场鼠李糖苷酶价格1100元/Kg),产品指标达到国内先进水平;

4.采用全水化提取工艺,避免乙醇等有机溶剂的污染,提取工艺环保、友好。

微信客服
迈科技微信号

打开微信
“扫一扫”